研究背景
脊髓损伤（SCI）多发生于30岁以下人群，其发病率在我国呈明显上升趋势。SCI后患者劳动力不同程度地丧失对家庭及社会均带來极大负担，因此促进SCI后功能修复重建具有重要意义。影响SCI后轴突再生的因素主要包括两方面，即损伤轴突周围存在不利于细胞生长的内环境及成熟神经元内再生能力减弱，其中胶质瘢痕的形成及其含有多种抑制成分，是影响轴突再生的重要外部闪素。形成胶质瘢痕的细胞成分包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、小胶质细胞等，其中最主要的是星形胶质细胞成分，其生物学特性在中枢神经损伤后发生一系列变化，被称为活化的星形胶质细胞。多年来许多研究探讨SCI后促进星形胶质细胞活化的多种分子机制，并尝试从信号通路、细胞周期等不同角度对其进行调控，在SCI修复方面取得了令人鼓舞的成果。
星形胶质细胞（astrocytes，AST）是脑中主要的支持细胞，在中枢神经系统（central nervous
system，CNS）中AST最丰富，其数量超出了神经元数量的5倍。然而我们对AST的了解远远落后于对神经元形态和功能的认识，原因可能是人们传统上认为AST只是简单地填充在神经元与神经元的空隙之间以及AST并不产生动作电位。AST支持着神经元的功能活动，包括促进突触形成、调节细胞外的离子浓度和神经递质、为神经元提供代谢底物、维持血脑屏障、摄入谷氨酸抑制兴奋性中毒、清除自由基、提供营养和生长因子。在CNS受损后AST被激活，形成反应性星形胶质细胞（reactive
astrocytes,RAS），如下图所示。已证实RAS会恢复成一种部分不成熟的分子状态，允许RAS再表达一系列因子／蛋白质修复受损部位的组织。RAS可表达胶质纤维酸性蛋白(glial
fibrillary acidic
protein,GFAP)、波形蛋白(vimentin)、S100β、巢蛋白(nestin)、谷氨酸／天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate
transporter)和胶质细胞谷氨酸转运体-1(glial glutamate
transporter-1)等，而表达GFAP是RAS的典型特征。在形态上的变化主要是AST胞体进行性肥大，细胞质变得丰富，可出现极化。同时RAS突起的平均体积，直径及分支程度均会有所增加。
反应性星形胶质细胞对轴突再生有着双重影响。一方面,反应性星形胶质细胞能分泌神经营养因子,具有神经保护和修复作用；另一方面,反应性星形胶质细胞若过度增殖形成胶质瘢痕,则抑制轴突再生,不利于神经功能恢复。AST是一类异质性，可塑性很强的细胞。CNS受损后，AST受到环境影响通过增殖，迁移至病变区域形成RAS，形成物理和化学屏障阻碍轴突再生。由于这些原因，AST一直被许多研究人员列为目标细胞，减少它们在受损区域的存在。然而RAS可执行许多内源性修复，且已证明消融AST后对恢复是有害的。同时许多神经系统疾病有着共同的病理机制如氧化应激、兴奋性中毒和代谢障碍等，均与调节AST功能相关。因此我们有必要发展更好的分子工具来指导和控制RAS的状态，以便当神经元处于不利条件时能将RAS转换成支持细胞保护神经元，维持神经功能的完整性。
研究模型
我们已经掌握了星形胶质细胞的原代分离培养：在冰上迅速取出新生1-2d的SD大鼠的大脑，用D-Hank液清洗并剔除脑膜和血管，取出大脑皮质，粉碎成1mm3左右的组织块，加入0.25%胰酶，37度消化10min。终止消化后，100目筛网机械过滤，1000rpm离心7min。将沉淀的细胞加入含10%FBS的DMEM/F12完全培养液后，吹打成单细胞悬液。计数后按1E5/cm2的密度接种于T25中。待培养的细胞70%融合时，将培养瓶置于恒温旋转摇床上旋转24h后，弃去悬浮细胞及培养液。星形胶质细胞的培养图片如下所示。
我们建立了LPS刺激星形胶质细胞活化的模型：在培养的星形胶质细胞中加入适量LPS，培养一段时间后，采用免疫荧光法检测活化标志GFAP的表达。如下图所示，LPS刺激后胞浆中GFAP荧光明显增强，细胞胞体肥大，突起粗壮。
研究案例
目的：阐明TRPC3在星形胶质细胞活化中的作用
结论：推测致炎因子引起星形胶质细胞活化的机制可能与TRPC3表达上调、钙离子内流增加有关
路线：
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观察LPS对星形胶质细胞的功能影响：LPS可引起星形胶质细胞活化，表现为星形胶质细胞增殖、GFAP表达上调及IL-6的分泌增加
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观察LPS对星形胶质细胞TRPC3的影响：LPS诱导胞浆和核内TRPC3表达增强关
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验证TRPC3是否参与LPS诱导的星形胶质细胞活化反应：利用2-APB和SKF96365两种TRPC通道阻断剂来观察LPS对星形胶质细胞增殖、GFAP表达和IL-6分泌的影响道有
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LPS诱导的胞外钙内流可能与TRPC通
核心文献
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Glia as drivers of abnormal neuronal activity. Nat Neurosci. 2015 Dec
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