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研究背景
间充质干细胞是干细胞家族的又一重要成员,源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞,属于非终末分化细胞,它既有间质细胞,又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞,一般都不会引起宿主的免疫反应。

典型的人间充质干细胞一般具有如下生物学特性:细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状贴壁生长,体外扩增至12代,细胞形态不发生明显改变,高表达间质细胞标记CD73(SH3,4)、CD105(SH2)、CD166,不表达造血细胞标记CD34、CD45。在适宜的诱导条件下,间充质干细胞能够较为容易地分化为软骨、成骨和脂肪细胞,如下图所示。目前,根据间充质干细胞的生物学特性,已建立骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织来源间充质干细胞的分离、培养、扩增和鉴定的实验方法。间充质干细胞最早在骨髓中发现,随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前,我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞,用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。

鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点,正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟,临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病;作为免疫调节细胞,治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。

最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的,他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC,在体外扩增培养4~7周,然后再静脉注射入患者体内,患者被分为3组,分别给予不同剂量的MSC,注射后没有观察到毒副作用,提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多,病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等,在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处:例如扩增能力个体差异很大;潜在的肿瘤细胞污染风险;培养需要一定的时间,不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。2004年,Le Blanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗GVHD获得成功,其后又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植治疗GVHD的有效性,并且认为在应用间充质干细胞治疗GVHD不需要严格的配型,其后又有多篇异基因未经配型的MSC治疗GVHD、促进造血重建的报道,其MSC来源涉及骨髓、脂肪、牙周等。

美国FDA已批准了近60项临床试验,主要包括以下几个方面:(1)造血干细胞移植:增强造血功能;促使造血干细胞移植物的植入;治疗移植物抗宿主病。(2)组织损伤的修复:骨、软骨、关节损伤、心脏损伤;肝脏损伤;脊髓损伤和神经系统疾病。(3)自身免疫病:系统性红斑狼疮、硬皮病、类风湿关节炎、血管炎、强直性脊柱炎、干燥综合征、白塞病、多肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化和炎性肠炎等。(4)作为基因治疗的载体。其中移植物抗宿主病、克隆氏病的治疗在美国已经进入到三期临床阶段。我国已开始用间充质干细胞治疗临床上一些难治性疾病,如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、类风湿关节炎、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等,根据初步的临床报告,间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得很明显疗效,部分患者摆脱了长期使用药物的困扰。

研究模型

我们已经掌握了间充质干细胞的原代分离培养:取大鼠两侧股骨和胫骨,剪去干骺端,用低糖DMEM从骨髓腔中冲出骨髓并打散。直接将细胞悬液接种于培养瓶中。原代取材培养后24h即有细胞贴壁。传代后细胞呈多角型贴壁均匀生长,如下图所示。

我们建立了间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化模型,分别进行了鉴定,如下图所示。

研究案例
目的:探讨Wnt通路对于体外培养的大鼠骨髓MSC向肌细胞特异性分化、增殖和迁移的影响
结论:激活经典Wnt通路,能够激活成肌相关基因的表达,诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌方向分化;能够抑制成脂相关基因的表达,抑制大鼠间充质干细胞向成脂方向分化
路线:
  • 1) pGKWnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞(L-M TK)鉴定及条件培养基制备
  • 2) Wnt3a对大鼠MSC增殖的影响分析:经Wnt3a-CM培养,能够激活大鼠MSC的经典Wnt信号通路;Wnt在体外能够特异性促进大鼠MSC的增殖
  • 3) Wnt3a对大鼠MSC向成肌分化的影响:应用Wnt3a-CM诱导MSC向成肌分化10天,可见有肌管形成。在Wnt3a-CM培养2d,可见有Pax7表达;在培养后4d,MyoD和Myf5开始表达。
  • 4) Wnt3a对大鼠MSC向成脂方向分化的影响:Wnt3a-CM显著抑制MSC向成脂方向分化;能够分别抑制C/EBP-a和PPAR-y的表达。
  • 5) 在体外Wnt3a能够促进MSC迁移
核心文献
  • 1) MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metab. 2015 Sep 9;S1550-4131. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1550-4131(15)00409-X
  • 2) Allogeneic Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Promote Healing of Refractory Perianal Fistulas in Patients With Crohn's Disease. Gastroenterology. 2015 Oct;149(4):918-27.e6. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0016-5085(15)00873-2
  • 3) Bone marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment in patients with severe ischaemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (MSC-HF trial). Eur Heart J. 2015 Apr 29;ehv136. 10.1093. http://eurheartj.oxfordjournals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=25926562
  • 4) Vascularized and Complex Organ Buds from Diverse Tissues via Mesenchymal Cell-Driven Condensation. Cell Stem Cell. 2015 May 7;16(5):556-65. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1934-5909(15)00115-0
  • 5) The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 2015 Apr;17(4):386-96. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/25799059/

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